Glosario
ESI-MS
También: espectrometría de masas por electrospray · ionización por electrospray · electrospray ionization mass spectrometry · ESI-MS · MS por electrospray · LC-MS (cuando va acoplada a cromatografía)
Determinación analítica que mide la masa molecular de un compuesto para confirmar que corresponde a la secuencia declarada en su ficha.
Qué es
ESI-MS es una determinación analítica que mide la masa de las moléculas presentes en una muestra. La sigla viene de electrospray ionization mass spectrometry: espectrometría de masas con ionización por electrospray.
El principio es en dos tiempos. Primero la ionización: la muestra disuelta se hace pasar por un capilar sometido a un voltaje alto, que la dispersa en gotas finísimas cargadas eléctricamente. El disolvente se evapora, las gotas se van encogiendo y acaban liberando las moléculas al estado gaseoso, cargadas y enteras: la carga no es un daño hecho a la molécula, son protones que el péptido ya tenía a su disposición en la disolución. Segundo la separación de los iones: se conducen a un analizador que los ordena por su relación masa/carga (m/z) y cuenta cuántos hay de cada una.
La palabra clave del párrafo anterior es enteras. El electrospray es una ionización suave: transfiere carga sin romper el esqueleto de la molécula. Eso es justamente lo que la hace apta para péptidos, que son moléculas grandes y frágiles: técnicas de ionización más energéticas los fragmentarían antes de poder pesarlos.
Un rasgo propio de esta técnica es que una misma molécula aparece varias veces en el espectro, con distinto número de cargas. Un péptido suele mostrarse como una serie de señales que corresponden a la molécula con una carga, con dos, con tres. El analista reconstruye a partir de esa serie —el paso se llama deconvolución— la masa de la molécula neutra, y esa es la cifra que se compara contra el peso molecular teórico calculado a partir de la secuencia de aminoácidos, en la modalidad —monoisotópica o promedio— que indique la especificación del producto.
Para qué sirve en un catálogo RUO
ESI-MS es la determinación con la que se confirma la identidad. Es la respuesta técnica a la pregunta más básica que se le puede hacer a un vial: lo que está adentro, ¿es la molécula que dice el rótulo?
El razonamiento es directo. La secuencia de aminoácidos declarada implica un peso molecular teórico exacto, que se calcula sumando la masa de cada residuo y la del agua que aportan los dos extremos de la cadena. Si la masa medida coincide con ese valor teórico dentro de la tolerancia que fija la especificación, el material es compatible con la secuencia declarada. Si no coincide, algo distinto está en el vial: otra secuencia, un análogo, un fragmento peptídico, un residuo cambiado, o una modificación no declarada.
La ventaja práctica es que las desviaciones se leen como diferencias de masa interpretables, no como un simple pasa/no pasa. Una diferencia que corresponde al peso de un residuo completo apunta a un residuo de más o de menos —una inserción o una deleción—, mientras que una diferencia igual a la que separa entre sí a dos residuos apunta a una sustitución; una que corresponde al peso de una molécula de agua, en menos, apunta a una condensación o a una ciclación, y en más, a una hidrólisis; una que corresponde al peso de un grupo protector apunta a una desprotección incompleta en la síntesis. La masa no dice solo que algo salió mal: sugiere qué.
Qué decisión depende de leerla bien
Al recibir un lote, la comprobación mínima antes de abrirlo es la misma siempre: tomar el certificado de análisis y verificar que la masa reportada por ESI-MS corresponde a la secuencia y al peso molecular teórico que aparecen en la ficha del producto. Si el certificado no trae masa medida, o trae una que no cuadra con la secuencia, el material queda en cuarentena hasta aclararlo. No hay inspección visual que sustituya esto: un liofilizado correcto y uno equivocado se ven idénticos.
La segunda lectura es la trazabilidad. La masa se determina sobre un lote concreto, y el número de lote del certificado debe coincidir con el impreso en el vial que se tiene en la mano. Un certificado de otro lote del mismo producto no es evidencia sobre este material.
Dos límites que conviene tener presentes. ESI-MS no distingue moléculas de masa idéntica: dos secuencias que difieren solo en el orden de sus residuos, o un par de aminoácidos intercambiables por peso, dan la misma masa. Cuando la especificación lo exige, la identidad se refuerza con fragmentación o con análisis de secuencia. Y ESI-MS no cuantifica el contenido del vial que no es péptido: sales residuales, contraiones y agua absorbida no se miden en esta determinación —a lo sumo asoman como aductos en el espectro—, aunque afecten cuánto material real hay en el vial. Esas preguntas se contestan con otras determinaciones de la especificación.
- La masa medida se compara siempre contra el peso molecular teórico de la secuencia declarada, no contra otro certificado.
- El número de lote del certificado debe coincidir con el del vial físico.
- Masa correcta no implica pureza suficiente: la pureza cromatográfica se lee aparte, en la determinación por HPLC.
- La tolerancia aceptable de la desviación de masa la fija la especificación del producto; se consulta en su ficha.
Con qué se confunde
Se confunde con HPLC, y son determinaciones que responden preguntas distintas. HPLC separa lo que hay en el vial y mide proporciones: responde «cuánto» del material corresponde al pico principal, y de ahí sale la pureza cromatográfica expresada en porcentaje de área. ESI-MS no separa nada ni mide proporciones: pesa, y responde «qué es» comparando la masa medida contra la masa teórica de la secuencia declarada. Por eso no se sustituyen. Un material puede dar una masa correcta por ESI-MS y aun así tener una pureza cromatográfica baja, porque el resto son impurezas que la MS no cuantifica; y puede dar un pico único que ocupe casi toda el área por HPLC siendo un compuesto distinto al del rótulo, si ese pico corresponde a otra molécula. Un certificado de análisis con pureza pero sin masa deja la identidad sin comprobar; con masa pero sin pureza deja el contenido sin comprobar. La otra confusión, menor, es leer el ion más intenso del espectro como si fuera el peso molecular: no lo es, es una relación masa/carga, y hay que deconvolucionar la serie de cargas para llegar a la masa neutra.